Η ολοκληρωθείσα ερευνητική πρόταση χαρακτηρίζεται από τρία καινοτόμα στοιχεία: (α) την εκτενή ποιοτική και ποσοτική μεταβολομική ανάλυση αυτοφυών φυτικών ειδών ιδιαίτερου φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. (β) Την εφαρμογή πρωτότυπων μεθοδολογιών για τη μελέτη και ανάλυση των συστατικών των φυτικών εκχυλισμάτων. (γ) Την εφαρμογή της φασματοσκοπίας NMR για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης μίγματος συστατικών με τη μη επισημασμένη μεταφέρουσα ανθρώπινη αλβουμίνη ορού και τη μιτοχονδριακή μεμβρανική αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε κατάσταση διαλύματος αλλά και καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την Bcl-2.
(Α) Ανάπτυξη ταχείας πλατφόρμας μεταβολομικής ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης που επιτρέπει, μέσα από μια ολιστική προσέγγιση, την ανάλυση φυτικών εκχυλισμάτων επιλεγμένου φυτικού υλικού και την ταχεία ταξινόμησή τους σε σχέση με τις βιοδραστικές ενώσεις τους. Τούτο επιτυγχάνεται με βάση:
1. Τη βελτιστοποίηση των μεθόδων δειγματοληψίας και εκχύλισης των φυτών.
2. Την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση της μεθοδολογίας NMR για την ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων με έμφαση: (i) την αύξηση της ευαισθησίας με τη χρήση της κρυογενικής NMR τεχνολογίας. (ii) Την εφαρμογή δισδιάστατης 2D NMR φασματοσκοπίας 1H-1H, 1Η-13C και επιλεκτικής μεθοδολογίας 1D TOCSY.
(Β) Ταχεία σάρωση βιοδραστικών μεταβολιτών, τόσο σε πολύπλοκα μίγματα εκχυλισμάτων όσο και απομονωμένων, για τη μελέτη της αλληλεπίδρασής τους με τη μεταφέρουσα ανθρώπινη αλβουμίνη ορού και τη μιτοχονδριακή μεμβρανική αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σε κατάσταση διαλύματος αλλά και καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την Bcl-2. Αυτό έχει επιτευχθεί με τη χρήση της φασματοσκοπίας Saturation Transfer Difference, STD, και Nuclear Overhauser Effect Correlation Spectroscopy, TR-NOESY.
Οι ακόλουθοι στόχοι και τελικά παραδοτέα έχουν επιτευχθεί.
Ερευνητική Εργασία ΕΕ1 (Επιλογή φυτικού υλικού – Βελτιστοποίηση των μεθόδων δειγματοληψίας και εκχύλισης). Επιλέχθηκε ένα εμπορικά διαθέσιμο καλλιεργημένο είδος Artemisia Annua στο οποίο δοκιμάστηκαν διάφορες μέθοδοι εκχύλισης. Η εκχύλιση με λουτρό υπερήχων και διαλύτη κανονικό εξάνιο με 5% οξικό αιθυλεστέρα και με διαιθυλαιθέρα έδωσε τα πιο πλούσια σε βιοδραστικά συστατικά εκχυλίσματα. Επιλέχθηκε το εκχύλισμα σε διαιθυλαιθέρα για περαιτέρω μελέτη. Επίσης, συλλέχθηκε φυτικό υλικό των ειδών Artemisia Absinthium και Οriganum majorana και εφαρμόστηκαν σύγχρονες μέθοδοι εκχύλισης.
Ερευνητική εργασία ΕΕ2 (Ποιοτική ανάλυση μεταβολιτών/Ποσοτική ανάλυση μεταβολιτών/Απομόνωση επιλεγμένων συστατικών των φυτικών εκχυλισμάτων). Επιλέχθηκε το εκχύλισμα του είδους ArtemisiaAnnua σε διαιθυλαιθέρα και το εκχύλισμα του είδους Artemisia Absinthium σε εξάνιο, καθώς παρουσίασαν το μεγαλύτερο ενδιαφέρον ως προς τη σύστασή τους σε βιοδραστικά συστατικά. Ολοκληρώθηκε η μελέτη της σύστασής τους με συνδυασμό τεχνικών δισδιάστατης φασματοσκοπίας NMR και με υγρή χρωματογραφία σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών (LC/DAD/ESI-MSn). Η ανάλυση αυτή περιελάμβανε ποιοτική και ποσοτική ανάλυση του συνόλου των μεταβολιτών τους με υψηλής ευαισθησίας και διακριτικής ικανότητας μεθοδολογίες NMR που έχουν αναπτυχθεί και εφαρμοστεί τα τελευταία χρόνια στο Εργαστήριό μας, καθώς και απομόνωση των βιοδραστικών συστατικών.
Ερευνητική εργασία ΕΕ3 (Σάρωση βιοενεργών συστατικών για την αλληλεπίδρασή τους με τη μεταφέρουσα ανθρώπινη αλβουμίνη ορού και την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 τόσο σε κατάσταση διαλύματος όσο και σε κυτταρικό επίπεδο. Έχει ολοκληρωθεί η μελέτη STD-NMR και Tr-NOESY NMR εκχυλισμάτων με την μεταφέρουσα αλβουμίνη ορού. Διαπιστώθηκε άμεση αλληλεπίδραση της αρτεμισίνης με την πρωτεΐνη, ενώ από πειράματα ανταγωνισμού με επιλεκτικούς αναστολείς της αλβουμίνης χαρτογραφήθηκαν και οι θέσεις πρόσδεσης. Επίσης πραγματοποιήθηκαν μελέτες με καρκινικά κύτταρα λευχαιμίας που υπερ-εκφράζουν την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση με την πρότυπη ένωση αρτεμισίνη. Η έρευνα αυτή θα αποτελέσει αντικείμενο περαιτέρω δημοσίευσης.
