Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα της σημερινής κοινωνίας και ειδικά της χώρας μας, είναι η υπογονιμότητα. Η προσπάθεια τεκνοποίησης των γυναικών σε προχωρημένη ηλικία, γενετικοί παράγοντες, ανατομικά και λειτουργικά προβλήματα του αναπαραγωγικού συστήματος και των δυο φύλων οδηγούν ολοένα και περισσότερα ζευγάρια να αναζητούν λύσεις στην ιατρικώς υποβοηθούμενη αναπαραγωγή. Μια από τις βασικότερες τεχνικές είναι η τεχνητή γονιμοποίηση (in vitro fertilization - IVF) κατά την οποία οι γυναίκες υπόκεινται σε ελεγχόμενη διέγερση των ωοθυλακίων, μέσω της χορήγησης κατάλληλων ορμονών προκειμένου να παράγουν όσο το δυνατόν περισσότερα ώριμα ωοθυλάκια. Ωστόσο, σε αρκετές περιπτώσεις η διαδικασία της διέγερσης δεν οδηγεί σε εγκυμοσύνη, είτε λόγω παραγωγής μικρού αριθμού και κακής ποιότητας ωοθυλακίων (χαμηλή απόκριση της γυναίκας – poor ovarian response) είτε λόγω πρόκλησης ανεπιθύμητων παρενεργειών όπως το σύνδρομο υπερδιέγερσης των ωοθηκών (OHSS) το οποίο χαρακτηρίζεται από την παραγωγή πάρα πολλών ωοθυλακίων και την επιβάρυνση της λειτουργίας των αγγείων που μπορεί να απειλήσει ακόμη και τη ζωή της γυναίκας. Τα αίτια είναι συνήθως ιδιοπαθή ή μπορεί να οφείλονται στον τρόπο διέγερσης. Επομένως, είναι επιτακτική η ανάγκη βελτίωσης αυτών των τεχνικών για να γίνει πιο αποτελεσματική η διαδικασία της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Εκτεταμένες προσπάθειες που γίνονται τα τελευταία χρόνια για την αποκρυπτογράφηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην απόκριση των ωοθυλακίων στην ορμονική διέγερση έχουν στρέψει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας στα συντηρημένα σηματοδοτικά μονοπάτια PI3k–Akt–mTOR και Hippo τα οποία είναι απαραίτητα για την ωρίμανση του ωαρίου, καθώς και για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των στηρικτικών – γειτονικών του κυττάρων όπως είναι τα κοκκώδη κύτταρα.
Σκοπός μας ήταν να ελέγξουμε την ενεργοποίηση και τον ρόλο των μονοπατιών mTOR και Hippo σε μοντέλα διέγερσης των ωοθηκών, αξιοποιώντας υλικό ανθρώπινων ωοθυλακίων, εστιάζοντας στα κοκκώδη κύτταρα τα οποία μπορούν να απομονωθούν από το ωοθυλακιακό υγρό μετά τη διαδικασία της τεχνητής γονιμοποίησης. Επιπλέον, θέλαμε να διερευνήσουμε τη φάση ωρίμανσης των ωοθυλακίων μετά από πρωτόκολλα διέγερσης, χρησιμοποιώντας γονίδια-δείκτες των διαφόρων φάσεων του ωοθυλακίου και να τη συγκρίνουμε με τη φάση ωρίμανσης ωοθυλακίων που προέρχονται από φυσιολογικό κύκλο. Παράλληλα, επιχειρήσαμε να ελέγξουμε τα χαρακτηριστικά των μικρών και των μεγάλων ωοθυλακίων - πιθανά ανώριμων και ώριμων, αντίστοιχα - που προέρχονται από πρωτόκολλα διέγερσης, τόσο στο επίπεδο της έκφρασης γονιδίων – δεικτών των φάσεων του ωοθυλακίου, όσο και στο επίπεδο ενεργοποίησης των μονοπατιών mTOR και Hippo μελετώντας την έκφραση πρωτεϊνών – στόχων τους, με σκοπό να κατανοήσουμε τα πιθανά αίτια αποτυχίας των μοντέλων διέγερσης να οδηγήσουν σε ωρίμανση των ωοθυλακίων ή τα αίτια που οδηγούν σε υπερδιέγερση. Απώτερος στόχος είναι η εξατομικευμένη βελτιστοποίηση των πρωτοκόλλων διέγερσης των ωοθυλακίων, και η μείωση των περιπτώσεων υπερδιέγερσης (OHSS) και χαμηλής απόκρισης των ωοθηκών.
Με την παρούσα μελέτη καταφέραμε να εγκαθιδρύσουμε στο εργαστήριό μας ένα πρωτόκολλο απομόνωσης των κοκκωδών κυττάρων, από ωοθυλάκια προερχόμενα από γυναίκες που υποβάλλονται σε τεχνικές υποβοηθουμένης αναπαραγωγής, στηριζόμενοι σε προηγούμενες προσπάθειες που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία. Πραγματοποιώντας κάποιες τροποποιήσεις, καταφέραμε να απομονώσουμε καθαρούς πληθυσμούς βιώσιμων κοκκωδών κυττάρων από ένα μεγάλο αριθμό γυναικών, τα οποία μπορούν να καλλιεργηθούν in vitro. Επίσης, παρατηρήσαμε έντονες διαφορές στο πρότυπο έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την ωρίμανση και την απόπτωση των κοκκωδών κυττάρων στα ωοθυλάκια που απομονώθηκαν από γυναίκες διαφορετικής ηλικίας, καθώς και από γυναίκες με πολυκυστικές ωοθήκες. Στα δείγματα αυτά, μελετήσαμε επίσης την ενεργότητα του μονοπατιού Hippo μέσω προσδιορισμού των επιπέδων mRNA των γονίδιων–στόχων του, και παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές μεταξύ των διαφορετικών κατηγοριών. Για τη μελέτη της δραστηριότητας του mTOR χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν ενεργοποιημένους στόχους του μονοπατιού και προσδιορίστηκαν τα επίπεδά τους σε ένα μέρος των δειγμάτων, χωρίς να παρατηρηθούν σημαντικές διαφορές. Ακόμη, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για την ανάλυση των εκκρινόμενων πρωτεϊνών και μεταβολιτών που υπάρχουν στο ωοθυλακικό υγρό, και προέκυψαν κάποια πρώιμα αποτελέσματα που αξίζει να διερευνηθούν περαιτέρω.
